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GB/T 23535-2009 脂肪酶制劑

【范圍】
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了脂肪酶制劑的術(shù)語(yǔ)和定義、產(chǎn)品分類、要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則和標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯存。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于以淀粉質(zhì)(或糖質(zhì))為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵、提純制得的中性脂肪酶制劑的生產(chǎn)、檢驗(yàn)和銷售。

【術(shù)語(yǔ)和定義】
下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
脂肪酶  lipase
能水解甘油三酯或脂肪酸酯產(chǎn)生單或雙甘油酯和游離脂肪酸，將天然油脂水解為脂肪酸及甘油，同時(shí)也能催化酯合成和酯交換反應(yīng)的酶。
脂肪酶活力  activity of lipase
脂肪酶活力以脂肪酶活力單位表示，定義為1g固體酶粉(或1mL液體酶)，在一定溫度和pH條件下，1min水解底物產(chǎn)生1μmol的可滴定的脂肪酸，即為1個(gè)酶活力單位，以u(píng)/g(u/mL)表示。

【產(chǎn)品分類】
按產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域
A類產(chǎn)品一一食品工業(yè)和飼料工業(yè)用酶制劑。
B類產(chǎn)品一一其他工業(yè)用酶制劑。
按產(chǎn)品形態(tài)
固體劑型酶制劑和液體劑型酶制劑。

【要求】
外觀
固體劑型: 白色至黃褐色粉末或顆粒，無(wú)結(jié)塊、無(wú)潮解現(xiàn)象。無(wú)異味。有特殊發(fā)酵氣味。
液體劑型: 淺黃色至棕褐色液體，允許有少量凝聚物。無(wú)異味。有特殊發(fā)酵氣味。
理化要求
應(yīng)符合表1的規(guī)定。


衛(wèi)生要求
應(yīng)符合國(guó) 家有關(guān)規(guī)定。

【試驗(yàn)方法】
酶活力
原理
脂肪酶在一定條件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油單酯和甘油，所釋放的脂肪酸可用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液進(jìn)行中和滴定，用pH計(jì)或酚酞指示液指示反應(yīng)終點(diǎn)，根據(jù)消耗的堿量，計(jì)算其酶活力。
反應(yīng)式為:

注1: 酯酶的存在會(huì)使檢測(cè)的脂肪酶的活力增加。蛋白酶的存在會(huì)降解脂肪酶，從而使檢測(cè)到的脂肪酶的活力減小。
注2: 洗滌劑的存在會(huì)嚴(yán)重影響本方法。依不同洗滌劑的類型和濃度不同，這種影響表現(xiàn)為從完全抑制到激活。
注3: 酶會(huì)附著在塑料上，因此應(yīng)用玻璃器皿溶解稀釋，同時(shí)也應(yīng)用玻璃器皿滴定。在溶液的轉(zhuǎn)移中如果時(shí)間很短，且選擇適當(dāng)?shù)乃芰喜馁|(zhì)，可以使用塑料移液槍頭。

【分析步驟】
待測(cè)酶液的制備
一一稱取酶樣品1g~2g，精確至0.0002g，用磷酸緩沖液溶解并稀釋。如果樣品為粉狀，可用少量磷酸緩沖液溶解后用玻璃棒搗研，然后將上清液小心傾入容量瓶中。

若有剩余殘?jiān)偌由倭苛姿峋彌_液充分研磨，最終樣品全部移入容量瓶中，用磷酸緩沖液定容至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)入高速勻漿機(jī)組織搗碎機(jī)搗研3min后供測(cè)定。
一一測(cè)定時(shí)控制酶液濃度，樣品與對(duì)照消耗堿量之差控制在1mL~2mL范圍內(nèi)。
吸取樣品時(shí)，應(yīng)將酶液搖勻后再取。

【測(cè)定】
電位滴定法(第一法)
a) 按pH計(jì)使用說(shuō)明書進(jìn)行儀器校正；
b) 取兩個(gè)100mL燒杯，于空白杯(A)和樣品杯(B)中各加入底物溶液4.00mL和磷酸緩沖液5.00mL，再于A杯中加入95%乙醇15.00mL，于40°C±0.2°C水浴中預(yù)熱5min，

然后于A、B杯中各加待測(cè)酶液1.00mL，立即混勻計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)15min后，于B杯中立即補(bǔ)加95%乙醇15.00mL終止反應(yīng)，取出；
c) 在燒杯中加入一枚轉(zhuǎn)子，置于電磁攪拌器上，邊攪拌，邊用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至pH10.3，為滴定終點(diǎn)，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。
指示劑滴定法(第二法)
a) 取兩個(gè)100mL三角瓶，分別于空白瓶(A)和樣品瓶(B)中各加入底物溶液4.00mL和磷酸緩沖液5.00mL，再于A瓶中加入95%乙醇15.00mL，于40°C±0.2°C水浴中預(yù)熱5min，

然后于A、B瓶中各加待測(cè)酶液1.00mL，立即混勻計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)15min后，于B瓶中立即補(bǔ)加95%乙醇15.0mL終止反應(yīng)，取出；
b) 于空白和樣品溶液中各加酚酞指示液兩滴，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至微紅色并保持30s不褪色為滴定終點(diǎn)，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。

【計(jì)算】
脂肪酶制劑的酶活力按式(1)計(jì)算:

式中:
X₁一一樣品的酶活力，u/g；
V₁一一滴定樣品時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位為毫升(mL)；
V₂一一滴定空白時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位為毫升(mL)；
c  一一氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，單位為摩爾每升(mol/L)；
50一一0.05mol/L氫氧化鈉溶液1.00mL相當(dāng)于脂肪酸50μmol；
n₁一一樣品的稀釋倍數(shù)；
0.05一一氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度換算系數(shù)；
1/15一一反應(yīng)時(shí)間15min，以1min計(jì)。
所得結(jié)果表示至整數(shù)。
精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的2%。

【附錄A  (資料性附錄)】
動(dòng)態(tài)滴定法測(cè)定脂肪酶的酶活力

【范圍】
本方法適用于測(cè)定含有或混有脂肪酶/酯酶樣品中的脂肪酶活力。
特殊的脂肪酶或特殊的成品制劑在樣品制備階段需采用特殊的穩(wěn)定或抽提手段以保證檢測(cè)到所有的脂肪酶活力。

【原理】
脂肪酶水解甘油三酯生成脂肪酸，使反應(yīng)體系的pH不斷下降。通過(guò)連續(xù)加入堿的方法保持反應(yīng)體系的pH恒定。堿滴定的速率與酶活力成比例。
注1: 酯酶的存在會(huì)使檢測(cè)的脂肪酶的活力增加。蛋白酶的存在會(huì)降解脂肪酶，從而使檢測(cè)到的脂肪酶的活力減小。
注2: 洗滌劑的存在會(huì)嚴(yán)重影響本方法。依不同洗滌劑的類型和濃度不同，這種影響表現(xiàn)為從完全抑制到激活。
注3: 酶會(huì)附著在塑料上，因此應(yīng)用玻璃器皿溶解稀釋，同時(shí)也應(yīng)用玻璃器皿滴定。在溶液的轉(zhuǎn)移中如果時(shí)間很短，且選擇適當(dāng)?shù)乃芰喜馁|(zhì)，可以使用塑料移液槍頭。
反應(yīng)式

反應(yīng)條件
溫度: 30°C±1°C。
pH: 7.00。
底物濃度: 0.16mol/L的三丁酸甘油酯。
反應(yīng)時(shí)間: 至少1.5min(只有線性反應(yīng)區(qū)用于計(jì)算斜率)。
分析范圍
樣品的分析范圍是0.2u/mL~4.0u/mL。如果可能，所有樣品應(yīng)在1.5u/mL~4.0u/mL的范圍內(nèi)被分析。
檢測(cè)限
對(duì)于液體樣品檢測(cè)限為20u/g，相當(dāng)于2.5g樣品溶解在10mL溶液中，然后再稀釋25倍。對(duì)于固體樣品檢測(cè)限為50u/g，相當(dāng)于1.0g樣品溶解在10mL溶液中，然后再稀釋25倍。

【儀器和設(shè)備】
具有動(dòng)態(tài)滴定(pH-stat)功能的滴定儀。在動(dòng)態(tài)滴定儀中還要注意選擇適當(dāng)?shù)膒H電極(對(duì)pH值響應(yīng)快)和滴定分配樣品準(zhǔn)確(特別是滴定氫氧化鈉)。

還要選擇玻璃滴定容器(帶水浴夾套)和有效的攪拌器(棒狀螺旋攪拌器優(yōu)于磁力攪拌)，這樣才構(gòu)成完整的系統(tǒng)。
乳化器。
恒溫水浴: 精度±0.2°C。
溫度計(jì): 精度±0.2°C。
自動(dòng)移液器。

試劑
除非另有說(shuō)明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和蒸餾水或去離子水或相當(dāng)純度的水。
三丁酸甘油酶(C₁₅H₂₆O₆)。
氯化鈉(NaCl)。
磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)。
阿拉伯膠。
甘氨酸(H₂NCH₂COOH)。
甘油[HOCH₂CH(OH)CH₂OH]。
氫氧化鈉片劑(NaOH)。
電極校正液(pH7.0)。
電極校正液(pH4.01)。
96%乙醇。
氮?dú)?N₂)。
氫氧化鈉溶液[c(NaOH)=1mol/L]: 按照 GB/T 601 配制。
氫氧化鈉滴定液[c(NaOH)=0.025mol/L]: 取上述溶液25mL，用水稀釋并定容到1000mL。
配好后需用適宜的設(shè)備脫氣。
氫氧化鈉滴定液[c(NaOH)=0.005mol/L]: 取氫氧化鈉滴定液25mL，用水稀釋并定容到5000mL。
乳化劑: 分別稱取阿拉伯膠30.0g、氯化鈉53.7g和磷酸二氫鉀1.20g。量取甘油1620mL 。
將大約180mL去離子水倒入400mL的燒杯中，加入攪拌子，開始高速攪拌，將阿拉伯膠緩慢倒入水中，不斷攪拌直至全部溶解。將稱好的氯化鈉和磷酸二氫鉀轉(zhuǎn)入到3L容量瓶中，

加350mL水充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙?，將甘油全部加入。將阿拉伯膠溶液轉(zhuǎn)入容量瓶中，充分?jǐn)嚢韬笥盟ㄈ荨?/span>
底物乳劑: 稱取三丁酸甘油酯62.5g，分別量取乳化劑200mL和水940mL，混合。將混合液勻漿器處理3min(7000r/min)。勻漿后的溶液先用普通的磁力攪拌攪拌至少20min，然后調(diào)節(jié)pH到4.75±0.05。
不同來(lái)源和批號(hào)的三丁酸甘油酯和阿拉伯膠對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有影響，在更換產(chǎn)品或批號(hào)前需進(jìn)行有效性確認(rèn)。
甘氨酸緩沖液1(7.51g/L): 稱取甘氨酸37.54g和氫氧化鈉片劑18.5g，用水溶解并定容到5L。如需要，調(diào)節(jié)溶液的pH到10.8±0.05。
甘氨酸緩沖液2(0.75g/L): 取100mL上述甘氨酸緩沖液1，用水定容到1000mL。如需要，調(diào)節(jié)溶液的pH到10.8±0.05。

【標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品處理】
標(biāo)準(zhǔn)曲線
稱取一定量的已知活力酶標(biāo)準(zhǔn)品，精確到0.0001g。然后用甘氨酸緩沖液2溶解并稀釋，制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的濃度為20u/mL。然后按照表A.1配制溶液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。


標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照
可使用已知活力的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的處理同樣品。
樣品處理
不同的樣品需做不同的預(yù)處理，以激活或保護(hù)在樣品基質(zhì)中的脂肪酶。
可考慮采用甘氨酸緩沖液1和水來(lái)分別溶解和稀釋樣品的方法，或甘氨酸緩沖液2來(lái)溶解和稀釋樣品的方法，或直接用水溶解和稀釋樣品的方法，以求得到最好的效果。樣品的溶解液和稀釋液應(yīng)充分?jǐn)嚢杈鶆颉?/span>
樣品應(yīng)最終稀釋到酶活力在1.5u/mL~4.0u/mL范圍內(nèi)。
如可能，樣品稀釋完應(yīng)立即測(cè)定。

【分析步驟】
系統(tǒng)準(zhǔn)備
按照無(wú)水乙醇、適當(dāng)?shù)姆试硭崴?、去離子水、底物的順序清洗滴定容器和管路。
保證水浴的溫度在30.0°C±0.5°C。
校正pH電極: 每天使用前要校正pH電極的靈敏度在95%~102%；pH7.00應(yīng)在6.985~6.989之間；pH4.01應(yīng)在4.009~4.012之間。如果達(dá)不到此標(biāo)準(zhǔn)，按照pH電極使用說(shuō)明進(jìn)行沖洗并再次校正。
分析
pH電極用后浸泡在飽和的氯化鉀(KCl)溶液中，使用前沖洗。
在反應(yīng)溶液表面用氮?dú)獯党洌苑乐箍諝庵卸趸嫉母蓴_。分析前一定要保證底物的溫度為30.0°C±0.5°C。
在分析每個(gè)樣品前要用0.005mol/L的氫氧化鈉溶液沖洗滴定皿和管路。
試驗(yàn)步驟如下:
一一將15mL的底物加入到滴定皿中。滴定前pH電極的讀數(shù)應(yīng)小于7.0。
一一加1mL樣品稀釋液加入到滴定皿中。反應(yīng)體系的pH在滴定過(guò)程中保持在7.0。記錄為保持恒定pH而加入的滴定液的量。
一一滴定結(jié)束后滴定儀打印出滴定曲線線性范圍的平均斜率(如果使用不同的設(shè)備，數(shù)據(jù)可能以其他形式輸出)。滴定曲線應(yīng)有一段持續(xù)1.5min的線性輸出。
一一先分析標(biāo)準(zhǔn)曲線(每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)分析1次)，然后分析一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，再分析樣品(每個(gè)樣品分析1次)。重要的是一天之中非一次運(yùn)行的樣品不能使用相同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。事先應(yīng)知道每一次運(yùn)行的樣品的個(gè)數(shù)。如果樣品在當(dāng)天晚些時(shí)候分析，標(biāo)準(zhǔn)溶液要重新分析。
一一每個(gè)樣品分析前和最后一個(gè)樣品完成分析后，系統(tǒng)將進(jìn)行沖洗。排空底物容器和管路，并用乙醇沖洗。如果系統(tǒng)將會(huì)在1周以上時(shí)間不再使用，則需要用去離子水進(jìn)行沖洗并用氫氧化鈉溶液或相同濃度的鹽酸溶液充滿敏感部件，避免出現(xiàn)鹽類結(jié)晶。

【計(jì)算】
結(jié)果計(jì)算
利用標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的測(cè)定值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中X 軸為標(biāo)準(zhǔn)品酶活力， Y 軸為相應(yīng)的滴定反應(yīng)的平均斜率(mL/min)。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該是一條直線。樣品稀釋液的活力從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出，然后按式(A.1)計(jì)算:

式中:
X₃一一樣品的酶活力，u/g；
A 一一稀釋樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出的酶活力，u/mL；
V₃一一樣品溶解用的容量瓶體積，單位為毫升(mL)；
n₂一一第二次稀釋的倍數(shù)；
m₃一一樣品的質(zhì)量，單位為克(g)。
結(jié)果的確認(rèn)
當(dāng)滿足以下條件時(shí)可以確認(rèn)本次分析有效:
一一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的檢測(cè)值在本方法所規(guī)定的可接受偏差范圍內(nèi)；
一一標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率應(yīng)滿足: 1) 標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)1小于0.02mL/min；2) 標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)6在0.14mL/min~0.18mL/min之間；
一一標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r²)大于等于0.995；
一一標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)~點(diǎn)6的相關(guān)系數(shù)的應(yīng)大于0.9995。標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)1~2的r²大于0.995是可接受的。
如果達(dá)不到此條件，應(yīng)檢查分析系統(tǒng)。
結(jié)果的表示
結(jié)果給出3位有效數(shù)字。如果結(jié)果低于檢測(cè)限，則表示為<20u/g(液體)或<50u/g(固體)。
精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的5%。

【實(shí)驗(yàn)儀器制備，推薦使用】 脂肪酶制劑的酶活力和動(dòng)態(tài)滴定法測(cè)定脂肪酶的酶活力

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產(chǎn)品操作演示：